本发明提供一种嗜酸乳杆菌抗冻培养基及其应用方法：包括16-20g葡萄糖、0.4-0.8g蒺藜多糖、3-5g酵母提取物、4-6g氯化钠、0.3-0.5g甘露醇、0.8-1.2g谷氨酸钠，8-12g大豆蛋白胨、0.5-2.0g柠檬酸氢二铵、0.2-0.5g甜菜碱、1.0-2.5g磷酸氢二钾、0.1-0.2g?MgSO4、0.5-1.0ml吐温80和1000ml蒸馏水。本发明具有以下优点：采用该抗冻培养基培养嗜酸乳杆菌后，可使其冻干存活率最高达79.54％，菌粉活菌数最高达4.09×1011cfu/g，而以嗜酸乳杆菌MRS肉汤培养，制备的菌粉冻干存活率仅为49.72％，活菌数仅为1.24×1011cfu/g。